Editat de Peter Sarnow, Școala de Medicină a Universității Stanford, Universitatea Stanford, California, aprobat la 25 decembrie 2020 (revizuit la 25 octombrie 2020)
Raportăm interacțiunea dintre subunități în replicarea complexelor coronavirus-transcripție, care sunt esențiale pentru replicare și conservare evolutivă.Am furnizat dovezi că domeniul NiRAN asociat cu nsp12 are activitate de transferază nucleozidă monofosfat (NMP) în trans și am identificat nsp9 (o proteină de legare a ARN) ca țintă.NiRAN catalizează atașarea covalentă a fragmentului NMP la capătul amino nsp9 conservat într-o reacție care se bazează pe ionii Mn2+ și pe reziduurile Asn conservate adiacente.S-a descoperit că activitatea NiRAN și nsp9 NMPylation sunt esențiale pentru replicarea coronavirusului.Datele ne permit să legăm această activitate a markerului enzimei virale imbricate cu observațiile anterioare în ipoteza că inițierea sintezei ARN într-o clasă de virusuri ARN este consecventă din punct de vedere funcțional și evolutiv.
ARN-polimeraza dependentă de ARN (RdRps) a Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae și alte 12 familii) este legată de domeniul amino-terminal (N-terminal) din proteina nestructurală (nsp) eliberată din poliproteină, numită NiRAN 1ab este compus din protează principală virală (Mpro).Anterior, a fost raportată propria activitate de GMPylation/UMPylation a virusului arterial NiRAN-RdRp nsp și s-a sugerat generarea unui tranzitoriu pentru transferul monofosfatului de nucleozid (NMP) către virusul (în prezent necunoscut) și/sau lucrurile de biopolimerizare celulară.Aici, arătăm că coronavirusul (Coronavirus uman [HCoV]-229E și sindromul respirator acut sever Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) are activitate de NMPylation dependentă de Mn2+, care este derivată din nsp9 prin formarea nsp9 mediată de Mpro După nsps-ul N-terminal de flancare este eliberat proteolitic, fosforamidatul este legat de amina primară (N3825) la N-terminalul nsp9.Trifosfatul de uridină este nucleotida preferată în această reacție, dar trifosfatul de adenozină, trifosfatul de guanozină și trifosfatul de citidină sunt de asemenea cosubstraturi adecvate.Studiile de mutație folosind proteine recombinate de coronavirus nsp9 și nsp12 și mutanți HCoV-229E modificați genetic au determinat reziduurile necesare pentru NMPilarea nsp9 mediată de NiRAN și replicarea virusului în cultura celulară.Datele au confirmat predicția reziduurilor de la locul activ NiRAN și au determinat rolul important al reziduurilor nsp9 N3826 în NMPilarea nsp9 și replicarea virusului in vitro.Acest reziduu face parte din secvența tripeptidă NNE N-terminală conservată și s-a dovedit a fi singurul reziduu invariant al nsp9 și omologii săi din familia coronavirusului.Acest studiu oferă o bază solidă pentru studiul funcțional al activității de NMPylation a altor virusuri imbricate și propune posibile ținte pentru dezvoltarea medicamentelor antivirale.
Virusul ARN cu catenă pozitivă Nidovirales infectează o varietate de vertebrate și nevertebrate (1, 2).Ordinul include în prezent 14 familii (3), dintre care familia Coronavirus a fost studiată pe larg în ultimii 20 de ani.La acel moment, trei coronavirusuri zoonotice au apărut de la gazde animale și au provocat focare pe scară largă de infecții respiratorii severe la oameni.Inclusiv pandemii persistente cauzate de boli infecțioase acute severe.Sindromul respirator Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidovirusurile au o organizare comună a genomului, iar subunitatea complexului de replicare-transcripție legat de membrană (RTC) este codificată în două treimi de la 5-a²-terminal și subunitatea structurală principală a particulei virale, precum și unele accesorii. .Proteină, codificată în treimea de capăt 3??² a genomului (1).Cu excepția unei familii de viruși planari (Monoviridae) (8), toți virusurile imbricate codifică subunități RTC în două cadre de citire deschise (ORF) ORF1a și ORF1b, care sunt traduse din ARN-ul genomic al.ORF1a codifică poliproteina (pp) 1a, iar ORF1a și ORF1b codifică împreună pp1ab.Cu participarea generală a proteazei principale (Mpro) codificată de ORF1a, atât pp1a, cât și pp1ab sunt procesate proteolitic într-o varietate de proteine nestructurale (nsps), cunoscute și sub numele de 3CLpro, deoarece are omologie cu 3Cpro al picornavirusului ( 9).Aceste nsps sunt considerate a fi asamblate într-un RTC dinamic mare, catalizează sinteza ARN genomic (replicare) și un set de ARN subgenomic (transcripție) și sunt utilizate pentru a coordona expresia ORF situat în aval de ORF1b (10?? ?12).
RTC de bază include ARN polimeraza dependentă de ARN (RdRp) (13), helicaza superfamilia 1 (HEL1) (14, 15) și mai multe enzime de procesare a ARN, care sunt codificate în principal în ORF1b și în familia coronavirusului. Conține nsp12-nsp16 și nsp9-nsp12 din familia Arterioviridae (vezi referința 10ââ 12).RdRp și HEL1 reprezintă două (o cincime) domenii conservate ale virusului cuibului de pasăre și au omologie cu alte virusuri ARN.Se crede că replicaza centrală este asistată de alte subunități, inclusiv câteva nsps mici eliberate din regiunea carboxi-terminală (C-terminală) a pp1a, în aval de Mpro (coronavirus nsp5 și, respectiv, virus arterial nsp4).Au o protecție limitată specifică familiei și activități diverse (revizuite în referința 10ââ12).
Relativ recent, a fost găsit un domeniu cu caracteristici unice de motiv de secvență la capătul amino terminal (N-terminal) adiacent la RdRp în toate virusurile imbricate, dar în niciun alt virus ARN (16).Pe baza locației sale și a activității nucleotid transferazei (nucleozid monofosfat [NMP] transferază), acest domeniu este numit NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).Combinația cu două domenii de NiRAN-RdRp constituie nsp12 în familia Coronaviridae și nsp9 în familia Arterioviridae, iar în alte nestoviridae, NiRAN-RdRp este de așteptat să fie eliberat ca un nsp independent din poliproteina virală.În coronavirus, domeniul NiRAN conține ??1/450 reziduuri și este conectat la domeniul RdRp C-terminal prin regiunea linker (16-19).În virusul arteritei ecvine (EAV) (Arteriviridae), nsp9 recombinant prezintă activități de UMPylation (auto) dependente de ioni Mn2+ și GMPylation, care depind de trei baze de secvență conservate în nestovirus, AN, BN și CN Resturile din secvență.Unde N reprezintă NiRAN) (16).Flancarea N-terminală a acestor motive este un motiv mai puțin conservator preAN.Unele dintre aceste reziduuri sunt, de asemenea, conservate în protein kinaze înrudite la distanță, unde s-a dovedit a fi implicate în legarea nucleozidelor trifosfat (NTP) și activitatea catalitică (20, 21).În concordanță cu această observație, mai multe reziduuri cheie ale locului activ din pseudokinaza SelO de la Pseudomonas syringae pot fi asamblate cu supercomplexul SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 recent publicat.Reziduuri conservate de Coronavirus NiRAN suprapuse în microstructura electronică.Proteina recombinantă (17).Se speculează că (auto) U/GMPylation documentată va produce o stare tranzitorie pentru a transfera NMP la substratul (în prezent necunoscut) (16), iar similaritatea structurală dintre NiRAN și protein kinaza (17, 19) este ipoteza că NiRAN modifică alte proteine.
Multe caracteristici, inclusiv asocierea sistematică unică și unică cu virușii imbricați și separarea genetică de RdRp, fac din NiRAN o enzimă de reglementare cheie rezonabilă pentru virusurile imbricate, care este esențială pentru apariția și identitatea lor.Anterior, au fost numite trei funcții posibile care implică NiRAN pentru a regla translația genomului/subgenomică sau replicarea/transcripția.Luând în considerare datele limitate și incomplete disponibile la momentul respectiv, fiecare funcție are avantajele și dezavantajele sale (16).În această cercetare, ne propunem să combinăm studiile biochimice și cele genetice inverse ale coronavirusurilor care reprezintă cele două genuri și să punem descoperirile noastre în fundalul evolutiv al mutației naturale a familiei de coronavirus, pentru a obține o perspectivă asupra acestui tărâm misterios.Raportăm progrese majore în înțelegerea NiRAN prin identificarea țintelor naturale în RTC, care (dintre cele trei ipoteze disponibile) contribuie la rolul acestui domeniu în inițierea sintezei de ARN viral imbricat.Această cercetare deschide, de asemenea, posibilități pentru alte roluri ale NiRAN pe interfața gazdă a virusului.
Pentru a caracteriza proprietățile enzimatice ale domeniului NiRAN legat de virusul corona nsp12, am produs o formă recombinată de coronavirus uman 229E (HCoV-229E) nsp12 în E. coli, cu o etichetă His6 la capătul C-terminal și am combinat proteină cu [α32-P] Se incubează împreună cu NTP în prezența MnCl2 așa cum este descris în Materiale și Metode.Analiza produsului de reacție a indicat prezența unei proteine marcate radioactiv care co-migrează cu nsp12 (106 kDa), indicând faptul că coronavirusul nsp12 catalizează formarea de aducti proteină-NMP covalente, formați de preferință cu monofosfat de uridină (UMP) (Figura 1A) și B).Analiza cantitativă a arătat că, în comparație cu alte nucleotide, intensitatea semnalului de încorporare a UMP a crescut de 2 până la 3 ori (Figura 1C).Aceste date sunt în concordanță cu activitatea NMP transferazei prezisă a domeniului NiRAN al coronavirusului (16), dar indică faptul că preferințele nucleotidice ale domeniului NiRAN al coronavirusului și ale virusului arterial sunt diferite.
Activitatea de auto-NMPilare a HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) a fost incubat cu [α-32P] NTP desemnat în prezența a 6 mM MnCl2 timp de 30 de minute (a se vedea Materiale și Metode pentru detalii).Produșii de reacție au fost separați prin SDS-PAGE și colorați cu albastru strălucitor Coomassie.(B) Proteina marcată radioactiv este vizualizată prin imagistica cu fosfor.Pozițiile nsp12-His6 și ale markerilor de masă moleculară a proteinei (în kilodaltoni) sunt prezentate în A și B. (C) Intensitatea semnalului radioactiv (media ± SEM) a fost determinată din trei experimente independente.*P≤0,05.Puterea semnalului (procentul) este legată de UTP.
Deși activitățile enzimatice legate de NiRAN s-au dovedit a fi esențiale pentru replicarea EAV și SARS-CoV în cultura celulară (16), funcția specifică NiRAN și țintele potențiale nu au fost încă determinate.Similitudinea structurală raportată recent între NiRAN și o familie de proteine cu pliuri asemănătoare proteinei kinazei (17, 22) ne-a determinat să testăm ipoteza că NiRAN catalizează NMPilarea altor proteine.Am generat un set de potențiale ținte omoloage, inclusiv proteine nestructurale codificate de HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), fiecare conținând o etichetă His6 C-terminală (apendicele SI, tabelul S1) și se incubează aceste proteine cu [α32-P]uridin trifosfat ([α32-P]UTP) în prezența sau absența nsp12.Albumina serică bovină și proteina de fuziune MBP-LacZα produsă în E. coli au servit drept martori (Figura 2A, benzile 1 până la 7).Proteina marcată radioactiv a fost analizată prin electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) și autoradiografie și s-a constatat că a existat un semnal radioactiv puternic în reacția care conține nsp12 și nsp9.Poziția semnalului corespunde masei moleculare a nsp9, indicând UMPylation mediată de nsp12 a nsp9 (Figura 2B, pista 7).Nu s-au găsit alte proteine de testare a fi UMPilate, ceea ce ne-a determinat să concluzionam că nsp9 este un substrat specific al nsp12.În conformitate cu datele de auto-NMPilare prezentate în Figura 1, nsp12 este capabil să transfere toate cele patru NMP-uri la nsp9, deși eficiența este diferită, UMP> adenozin monofosfat (AMP)> guanozin monofosfat (GMP)> citidin monofosfat (CMP) ) ( Imagine).3 A și B).În condițiile utilizate în acest test (scurtați timpul de reacție și expunere, reduceți concentrația de nsp12; materiale și metode), auto-NMPilarea nsp12 nu a putut fi detectată (comparați Figura 2B, banda 7 și Figura 1B), care sa dovedit un UMP eficient (Și mai multe runde) sa mutat de la nsp12 la nsp9.Activitatea transferazei UMP necesită prezența ionilor de Mn2+, așa cum se arată în Figura 3C, în timp ce doar activitatea transferazei UMP minimă a fost observată în prezența Mg2+ și nicio activitate în prezența celorlalți doi cationi divalenți testați.Date similare au fost obținute în testele de NMPilare care conțin citidin trifosfat (CTP), guanozin trifosfat (GTP) și adenozin trifosfat (ATP) (anexa SI, Figura S1).
UMPilarea nsp9 mediată de HCoV-229E nsp12.O serie de substraturi proteice (inclusiv albumina serică bovină, MBP-lacZα și o serie de nsps HCoV-229E marcate cu His6 C-terminal codificat de ORF1a) au fost utilizate pentru a evalua activitatea de UMPilare a HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediată proteină.Se incubează proteina cu [α-32P] UTP timp de 10 minute în absența (A) sau prezența (B) a nsp12 așa cum este descris în materiale și metode.În partea de sus a lui A și B, este prezentat gelul SDS-poliacrilamidă colorat cu Coomassie Brilliant Blue, iar în partea de jos a lui A și B sunt prezentate autoradiogramele corespunzătoare.Poziția markerului de masă moleculară a proteinei (în kilodaltoni) este dată în stânga.Poziția nsp12-His6 (B, sus) și semnalul radioactiv observat în timpul incubării nsp12-His6 cu nsp9-His6 (B, banda 7) sunt de asemenea indicate, ceea ce indică faptul că [α-32P]UMP la nsp9-His6 (12,9 kDa), ceea ce nu a fost observat pentru alte proteine testate.
Caracterizarea biochimică și virologică mediată de HCoV-229E NiRAN a NMPilării nsp9.(A și B) Rolul co-substratului nucleotidic utilizat în reacție.Nsp12-His6 și nsp9-His6 sunt amestecate și incubate în prezența diferitelor [α-32P] NTP în testul standard de NMPilare.(A, sus) nsp9-His6 colorat cu Coomassie separat prin SDS-PAGE.(A, jos) Autorradiografia aceleiași zone a gelului.(B) Activitatea relativă (media ± SEM) în prezența cofactorului nucleotid desemnat este determinată din trei experimente independente.*P≤0,05.(C) Rolul ionilor metalici.Este prezentat testul standard de NMPilare în prezența [α-32P] UTP și diferiți ioni metalici, fiecare cu o concentrație de 1 mM.În C, în partea de sus, este prezentată nsp9-His6 colorat cu Coomassie, iar în C, în partea de jos, este prezentată autoradiografia corespunzătoare.Mărimea proteinei marcate (în kilodaltoni) este afișată în stânga lui A și C. (D) Forma mutantă a HCoV-229E nsp12-His6 care poartă substituția specificată de aminoacid este în [α-32P]UTP, așa cum este descris în Materiale și Metode.Nsp9-His6 radiomarcat produs în reacția de NMPylation este detectat prin imagistica de fosforilare (D, sus).Activitatea relativă în comparație cu proteina de tip sălbatic (wt) este prezentată în D, iar partea de jos este luată ca medie (± SEM) din trei experimente independente.Asteriscurile indică substituții ale reziduurilor neconservate.(E) Titrul virusului în supernatantul de cultură al celulelor p1 obținut la 24 de ore după infectare a fost determinat prin analiza pe placă.Sunt indicate substituțiile de codon din domeniul NiRAN al mutantului HCoV-229E modificat (numerotarea reziduurilor se bazează pe poziția lor în pp1ab).S-a utilizat ca martor mutantul site-ului activ RdRp cu deficit de replicare nsp12_DD4823/4AA.
Pentru a obține o înțelegere mai profundă a situsului activ al NiRAN și a determina reziduurile legate de activitatea transferazei NMP specifice nsp9, am efectuat analiza mutațiilor, în care am înlocuit reziduurile conservatoare din motivele NiRAN AN, BN și CN ( 16) Este Ala (anexa SI, Figura S2).În plus, impactul substituțiilor conservatoare Arg-to-Lys sau Lys-to-Arg a fost evaluat în două cazuri.Ca control (negativ), reziduurile care nu sunt sau mai puțin conservate în domeniul NiRAN al coronavirusurilor și al altor viruși imbricați sunt înlocuite cu Ala. Înlocuirea K4116A (în motivul preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motivul). BN) și D4280A (CN) reduc sau chiar elimină semnificativ nsp9 NMPylation prin nsp12, în timp ce proteinele cu substituții conservatoare (R4178K), K4116R) păstrează 60% și 80% din activitatea lor, ceea ce indică faptul că relaxarea restricțiilor de partea lor respectivă. lanțurile sunt sensibile din punct de vedere fizico-chimic (Figura 3D).Înlocuirea altor câteva reziduuri conservate E4145A, D4273A, F4281A și D4283A este mult mai puțin dăunătoare, iar UMPilarea nsp9 este redusă doar moderat.Rezultate similare au fost obținute în reacțiile de NMPilare nsp9 care implică alte NTP (Figura 3D și apendicele SI, Figura S3), confirmând faptul că efectele observate asupra substituțiilor specifice de aminoacizi sunt independente de tipul de co-substrat nucleotidic utilizat.Apoi, am testat posibilul impact al acestor substituții nsp12 asupra replicării coronavirusurilor în cultura celulară.În acest scop, am folosit modele adecvate de ADN complementar (ADNc) modificate genetic, donate în virusul vaccinia recombinant (23, 24) pentru a transcrie 5 -7 celule.Titrarea descendenților virusului infecțios produs în aceste celule a arătat că majoritatea mutanților HCoV-229E NiRAN nu au fost realizabili (Figura 3E).Un grup de mutanți virali neviabile include alternative despre care s-a demonstrat că elimină sau reduc semnificativ activitatea NMP transferazei in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), dar există alte două alternative (K4116R, E4145A) % rezervat?Activitatea lor de NMPylation in vitro sugerează că sunt implicate restricții suplimentare.În mod similar, alte două mutații (R4178K, F4281A) care au cauzat o scădere moderată a activității de NMPylation in vitro a NiRAN au produs viruși vii, totuși, acești virusuri au redus semnificativ titrurile prin replicare.În concordanță cu datele de activitate in vitro prezentate în Figura 3D, înlocuirea altor patru reziduuri care nu sunt conservate în coronavirus și/sau în alți viruși imbricați (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) a produs viruși viabili. Descendența, în ciuda faptului că avea un titru moderat redus în comparație cu virusul de tip sălbatic (Figura 3E).
Pentru a studia dacă activitatea transferazei NMP mediată de NiRAN depinde de domeniul activ RdRp, cele două resturi Asp conservate implicate în coordonarea ionilor metalici divalenți (11) în motivul C RdRp au fost înlocuite cu Ala. Proteina rezultată reține nsp12_DD4823/4AA. activitatea sa de NMPilare a nsp9, indicând faptul că activitatea de NMPilare a nsp9 in vitro mediată de nsp12 nu necesită activitate de polimerază (Anexa SI, Figura S4).
După stabilirea activității NMP transferazei specifice nsp9 pentru nsp12, am încercat să caracterizăm aductul NMP-nsp9 prin spectrometrie de masă (MS).Spectrul complet de masă proteică al recombinantului HCoV-229E nsp9 a arătat un vârf la 12.045 Da (Figura 4A).Adăugarea de nsp12 nu a schimbat calitatea nsp9, indicând faptul că nsp12 și nsp9 nu ar forma un complex stabil în condițiile utilizate (denaturare) (Figura 4A).În prezența UTP și GTP, măsurarea masei reacției care conține nsp9 și respectiv nsp12 a arătat că masa proteică a UTP s-a deplasat cu 306 Da, iar masa proteică a GTP s-a mutat cu 345 Da, indicând că fiecare moleculă nsp9 leagă un UMP sau GMP. (Imaginea 4) C și D).Se speculează că energia necesară pentru NMPilarea nsp9 mediată de NiRAN provine din hidroliza NTP și eliberarea de pirofosfat.Deși în această reacție a fost utilizat un exces molar de 10 ori de nsp9 (țintă) decât nsp12 (enzimă), a fost observată NMPilarea aproape completă a nsp9, ceea ce indică faptul că interacțiunea dintre nsp12 și nsp9 este de scurtă durată, iar nsp12 poate NMPilează mai mult nsp9. moleculă in vitro.
NMPilarea unică a nsp9 în prezența nsp12 și UTP sau GTP.Este prezentat spectrul de masă complet deconvolut al proteinei HCoV-229E nsp9 (apendicele SI, Tabelul S1) (AD).(A) nsp9 singur, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 în prezența UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 în prezența GTP.
Pentru a determina resturile de nsp9 UMPilate de nsp12, nsp9-UMP a fost scindată cu tripsină.Peptidele rezultate au fost separate prin nanocromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) și analizate prin spectrometrie de masă în tandem (MS/MS) online.Analiza datelor folosind pachetul software Byonic (Protein Metrics) a arătat UMPilarea aminoacidului N-terminal.Acest lucru este confirmat manual.Spectrul de masă în tandem al peptidei precursoare [UMP]NNEIMPGK (apendicele SI, Figura S5A) a evidențiat un fragment la 421 m/z, indicând că UMP se leagă de restul 1 al nsp9.
La capătul N-terminal al nsp9, Asn este conservat printre membrii Orthocoronavirinae (apendicele SI, Figura S6).Deși credem că azotul amino primar N-terminal este cel mai probabil acceptor pentru UMP, am decis să obținem dovezi suplimentare ale legării NMP la N-terminal.Din acest motiv, peptida N-terminală neNMPilată și NMPilată nsp9 purificată prin HPLC a fost derivată în prezență de acetonă și cianoborohidrură de sodiu.În aceste condiții, numai aminele primare libere pot fi modificate cu propil (25).Peptida N-terminală derivată de nsp9 cu secvența NNEIMPGK conține două amine primare, una la capătul N-terminal al Asn și cealaltă la lanțul lateral al Lys la capătul C-terminal.Prin urmare, grupările propil pot fi introduse la ambele capete.Cromatogramele ionice extrase ale peptidelor non-NMPilate sunt prezentate în apendicele SI, Figura S5B.După cum era de așteptat, peptidele N-terminale și C-terminale (mono)propilate (apendicele SI, Figura S5B, banda superioară) și peptidele dipropilate (apendicele SI, Figura S5B, banda inferioară) pot fi identificate.Acest model se schimbă odată cu utilizarea peptidei NMPilate N-terminale a nsp9.În acest caz, pot fi identificate numai peptidele propilate C-terminale, dar peptidele propilate N-terminale și peptidele dipropilate nu sunt identificate (Anexa SI, Figura S5C), indicând că UMP a fost transferat la amina primară N-terminală. Pentru a preveni acest lucru grup de a face modificări.
Apoi, înlocuim (cu Ala sau Ser) sau ștergem reziduurile conservate la capătul N-terminal al nsp9 pentru a defini constrângerile specifice țintei.Pe baza datelor noastre MS care arată că NiRAN formează un aduct nsp9-NMP cu amina primară a reziduului N-terminal al nsp9, am emis ipoteza că nsp9 NMPylation necesită proteaza master virală (Mpro, nsp5) pentru a elibera N-terminalul nsp9 din precursorul său poliproteic.Pentru a testa această ipoteză, am produs o proteină precursoare nsp7-11 care conține nsp9 în E. coli și am efectuat un test standard de NMPylation în prezența [α-32P] UTP (materiale și metode).După cum se arată în Figura 5A (banda 3), precursorul nsp7-11 netăiat nu este radiomarcat cu nsp12.În schimb, dacă nsp7-11 este scindat de nsp5 recombinant pentru a elibera nsp9 (și alte nsps) din precursor, este detectată o proteină marcată radioactiv care migrează cu nsp9, confirmând concluzia noastră că NiRAN și formarea N-selectivă a aducților nsp9-NMP covalenti .Amina primară terminală a Asn N-terminal (poziția 3825 în pp1a/pp1ab).Această concluzie este susținută și de experimente care utilizează constructul nsp9, care conține unul sau două resturi suplimentare la capătul N-terminal.În ambele cazuri, UMPylation mediată de NiRAN a nsp9 a fost abolită (Anexa SI, Figura S7).Apoi, am produs o proteină cu unul sau două resturi Asn șterse din secvența peptidei 3825-NNEIMPK-3832 la N-terminalul nsp9.În ambele cazuri, nsp9 UMPylation a fost complet blocată (Figura 5B), oferind dovezi suplimentare că capătul N-terminal real nsp9 acționează ca un receptor NMP.
Procesarea proteolitică a nsp9 și rolul reziduurilor N-terminale în UMPilarea mediată de nsp12.(A) nsp9 UMPylation necesită un N-terminal liber nsp9.Nsp7-11-His6 este pre-incubat la 30 °C în tampon de detectare a NMPilării care conține UTP în prezența sau absența Mpro recombinant (nsp5-His6).După 3 ore, începeți testul NMPylation prin adăugarea de nsp12-His6 așa cum este descris în Materiale și metode.Reacția care conține nsp5-His6 (banda 1) și nsp9-His6 (banda 2) a fost utilizată ca martor.După 10 minute, reacţia a fost încheiată şi amestecul de reacţie a fost separat prin SDS-PAGE.Proteina a fost colorată cu Coomassie Brilliant Blue (A, sus).Precursorul Nsp7-11-His6 și produsul procesat rezultat din clivajul mediat de nsp5-His6 sunt prezentate în partea dreaptă.Vă rugăm să rețineți (din cauza dimensiunii lor mici) că nsp7 și nsp11-His6 nu sunt detectabile în acest gel, iar reacția este completată cu nsp5-His6 (culorile 1 și 4; poziția nsp5-His6 este indicată printr-un cerc solid) sau nsp9-His6 (banda 2) conține o cantitate mică de MBP (indicată prin cercuri deschise) ca impurități reziduale deoarece acestea sunt exprimate ca proteine de fuziune MBP (anexa SI, Tabelul S1).(B) Varianta Nsp9-His6 nu are unul sau două resturi Asn N-terminale (numerotarea reziduurilor în funcție de poziția în pp1a/pp1ab) și este purificată și incubată cu nsp12-His6 și [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE colorat cu Coomassie este prezentat în partea de sus, B, autoradiografia corespunzătoare este prezentată în partea de jos.Poziția markerului de greutate moleculară (în kilodaltoni) este afișată în stânga.(C) Reziduurile conservate N-terminale nsp9-His6 HCoV-229E au fost înlocuite cu Ala sau Ser și aceeași cantitate de proteină a fost utilizată în reacția de UMPilare mediată de nsp12-His6.Produșii de reacție au fost separați prin SDS-PAGE și colorați cu Coomassie Brilliant Blue (C, sus) și nsp9-His6 radiomarcat a fost detectat prin imagistica fosforescență (C, mijloc).Folosind proteina de tip sălbatic (greutate) ca referință (setată la 100%), activitatea relativă de NMPilare (media ± SEM) a fost calculată din trei experimente independente.(D) Titrurile de virus în supernatantul culturii de celule p1 al celulelor Huh-7 infectate cu celule Huh-7 de tip sălbatic HCoV-229E și mutanții care poartă substituții de aminoacizi desemnate în nsp9 au fost determinate prin testul plăcii.Motivul RdRp cu deficit de replicare C dublu mutant DD4823/4AA a fost utilizat ca martor negativ.
Capătul N-terminal al nsp9 (în special pozițiile 1, 2, 3 și 6) este foarte conservat printre membrii subfamiliei Orthocoronavirinae (apendicele SI, Figura S6).Pentru a studia posibilul rol al acestor reziduuri în NMPilarea nsp9 mediată de nsp12, două resturi Asn consecutive la capătul N-terminal al nsp9 au fost înlocuite cu Ala sau Ser (singur sau în combinație).În comparație cu nsp9 de tip sălbatic, înlocuirea N3825 cu Ala sau Ser a dus la o reducere de mai mult de două ori a UMPilării mediate de nsp12 (Figura 5C).În concordanță cu concluzia noastră că NMPilarea are loc la amina primară N-terminală în loc de lanțul lateral al reziduului N-terminal, am observat o NMPilare reziduală semnificativă cu înlocuirea N3825A și N3825S.Interesant este că dacă al doilea Asn este înlocuit cu Ala sau Ser, UMPylation nsp9 este redusă mai puternic (de peste 10 ori), în timp ce înlocuirea Ala în pozițiile 3, 4 și 6 are doar un efect moderat asupra UMPylation nsp9 (Figura 2). ).5C).Rezultate similare au fost obținute utilizând ATP, CTP sau GTP (anexa SI, Figura S8).Colectiv, aceste date indică rolul cheie al N2826 (poziția 2 în nsp9) în NMPylation nsp9.
Pentru a obține dovezi suplimentare ale corelației funcționale dintre capătul N-terminal al nsp9 și NMPylation, am efectuat o aliniere a secvenței multiple (MSA) a secvenței nsp9 a familiei Coronavirus (variind între 104 și 113 reziduuri) (Anexa SI, Figura). S6).În total, în 47 de specii (cunoscute și presupuse) din 5 genuri ale subfamilia Orthocoronavirinae care infectează diferite mamifere, păsări și gazde reptile, doar 8 reziduuri în total s-au dovedit a fi invariante.Cele mai extinse modificări, inclusiv deleții și inserții, au fost observate în ciclurile dintre elementele structurii secundare ale nsp9, așa cum au fost determinate de studiile structurale anterioare (26-28).Au fost găsite cinci reziduuri invariante în catena β și helixul α a părții C-terminale a nsp9.Trei reziduuri invariante constituie motivul NNE al capătului N terminal al nsp9.Se dezvăluie că al doilea Asn al acestui motiv este singurul reziduu invariant, care este, de asemenea, împărtășit de ipoteticul nsp9 al coronavirusului de broaște înrudit la distanță și reprezintă specia Microhyla letovirus 1 din subfamilia Letovirinae a Alphaletovirus.Conservarea reziduurilor în elementele structurii secundare nsp9 poate fi raționalizată prin considerații structurale pentru a menține proprietățile de pliere sau de legare a ARN cunoscute.Cu toate acestea, acest raționament nu pare să se aplice pentru conservarea NNE și, înainte de acest studiu, natura constrângerilor care limitează variația secvenței tripeptide a fost complet ascunsă.
Pentru a determina importanța nsp9-NMPilării și conservării NNE în replicarea coronavirusului, am produs mutanți HCoV-229E, care poartă substituții simple sau duble ale reziduurilor N-terminale nsp9, ceea ce indică faptul că nsp9 NMPylation este dăunătoare in vitro.Înainte de a începe, încercăm să răspundem la întrebarea dacă aceste substituții (în apropierea site-ului de clivaj nsp8|9) afectează procesarea proteolitică a regiunii pp1a C-terminale.Un set de constructe poliproteice nsp7-11 conţinând substituţii corespunzătoare la capătul N-terminal al nsp9 au fost produse în E. coli şi tăiate cu Mpro recombinant.Scindarea proteolitică a celor patru situsuri (inclusiv site-ul de flancare nsp9) nu este afectată semnificativ de nicio substituție introdusă (apendicele SI, Figura S9), excluzând modificările structurale ale acestor proteine care interferează cu clivajul nsp8|9 mediat de Mpro (sau altele) site-ul web.
Celulele Huh-7 au fost transfectate cu ARN HCoV-229E cu lungimea genomului, care codifică substituții Ala sau Ser în tripeptidele NNE conservate (N3825, N3826 și E3827) la capătul N nsp9, arătând că majoritatea mutațiilor sunt fatale.Am reușit să salvăm virusul prin înlocuirea Ser sau Ala a N-terminalului Asn (N2835A sau N2835S), dar nu am reușit să recuperăm virusul cu alte mutații simple și duble în secvența NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figura 5D).
Aceste rezultate indică faptul că replicarea coronavirusurilor în cultura de țesut este restricționată (la fel sau similar), limitând mutația naturală a site-urilor de NMPylation nsp9 din organism și susținând rolul cheie al acestui răspuns în ciclul de viață al coronavirusurilor.
În ultimul set de experimente, am produs His6 C-terminal etichetat SARS-CoV-2 nsp12 și nsp9 și două forme mutante de nsp12 în E. coli.Reziduurile site-ului activ din domeniile NiRAN și RdRp au fost, respectiv, Utilizați Ala (Figura 6A și apendicele SI, Tabelul S2).K4465 în SARS-CoV-2 nsp12 corespunde cu K4135 în HCoV-229E (Anexa SI, Figura S2), care s-a dovedit a fi necesar pentru activitatea NiRAN și replicarea HCoV-229E (Figura 3D și E).Acest reziduu corespunde, de asemenea, reziduului virusului arterial EAV nsp9 K94, care s-a dovedit anterior a fi necesar pentru auto-UMPilarea/auto-GMPilarea NiRAN (16).După cum se arată în Figura 6B, SARS-CoV-2 nsp12 are activitate UMP transferază folosind nsp9 ca substrat, în timp ce mutantul site-ului activ nsp12_K4465A este inactiv.Substituția dublă în secvența caracteristică SDD a motivului C RdRp nu afectează activitatea transferazei UMP (Figura 6B), indicând faptul că activitatea RdRp nu are efect direct în UMPilarea nsp9.Date similare au fost obținute utilizând CTP, GTP și ATP (anexa SI, Figura S10).În rezumat, aceste date indică faptul că NMPylation nsp9 mediată de NiRAN are o activitate conservatoare în coronavirusuri reprezentând diferite genuri ale subfamiliei ortocoronavirus.
NMPilarea nsp9 mediată de SARS-CoV-2 nsp12.(A) Gel SDS-poliacrilamidă colorat cu Coomassie care arată proteina recombinantă utilizată în testul NMPylation.Ca control, a fost utilizată o proteină mutantă cu substituție de situs activ în domeniul NiRAN (K4465A) și domeniul RdRp (DD5152/3AA) al SARS-CoV-2 nsp12.Numerotarea reziduurilor se bazează pe poziția din pp1ab.(B) Autoradiograful detectării UMPilării utilizând nsp9-His6 și [α-32P]UTP ca substrat al nsp12-His6 (tip sălbatic [wt] și mutant).Masa moleculară (în kilodaltoni) a proteinei marcate este afișată în stânga.
Domeniile NiRAN sunt în general conservate în Nidovirales (16), ceea ce indică faptul că ele catalizează reacții enzimatice esențiale pentru replicarea Nidovirusului.În acest studiu, am reușit să demonstrăm că domeniul NiRAN al coronavirusului transferă NMP (generat din NTP) la nsp9, o proteină misterioasă de legare a ARN-ului implicată în replicarea virusului (26 ?? 29), pentru a-l determina ca o țintă naturală și partener al coronavirusului RTC.
Domeniul NiRAN împărtășește trei motive de secvență (AN, BN și CN), care conțin un număr foarte mic de reziduuri care sunt conservate în toate familiile din ordinul Nidovirales monofiletic, dar foarte diferențiat (8, 16).Studii recente au arătat că acestea sunt legate structural de o familie în mare măsură necaracterizată de proteine asemănătoare protein kinazei, care au fost numite inițial familia SelO (17, 19, 22, 30, 31).Proteinele înrudite cu SelO au pliuri kinazei, dar le lipsesc câteva reziduuri de situs activ conservate în kinazele clasice (22, 32).Pe baza orientării inverse a moleculelor de ATP legate de situsul activ și stabilizate prin interacțiuni specifice, s-a emis ipoteza și ulterior confirmat că SelO transferă AMP (în loc de fosfat) pe substratul proteic (22), în timp ce o altă proteină bacteriană asemănătoare SelO YdiU are recent sa demonstrat că catalizează atașarea covalentă a UMP la reziduurile Tyr și His ale diferitelor substraturi proteice (33).
Pentru a confirma și extinde predicția reziduurilor presupuse ale site-ului activ din domeniul coronavirusului NiRAN, am folosit metode biochimice și de genetică inversă pentru a efectua analiza mutațiilor asupra coronavirusului nsp12 (Figura 3D și apendicele E și SI, Figura S3 și tabelul) S1â S4).Datele arată că înlocuirea HCoV-229E K4135, R4178 și D4280 cu Ala elimină activitatea NMP transferazei in vitro și replicarea virusului în cultura celulară (Figura 3D și apendicele E și SI, Figura S3), susținând prezența lor în NTP γ-fosfat (K4135, R4178) și coordonarea ionilor metalici ai locului activ (D4280).S-a demonstrat că înlocuirea E4145A a Glu-ului conservat în intervalul virusului cuibului de pasăre prezis că va stabiliza poziția K4135 (17) elimină replicarea virală, dar, în mod surprinzător, activitatea a fost reținută în testul NMPylation in vitro (Figura 3D și E și apendicele SI, figura S3 și tabelele S1–S4).O observație similară a fost făcută atunci când substituția corespunzătoare a fost introdusă în omologul YdiU al Salmonella typhimurium (E130A) (33).Luate împreună, aceste date susțin funcția de reglare a acestui reziduu conservat mai degrabă decât funcția catalitică.
Înlocuirea reziduului Phe conservat (F4281A) în intervalul de nestovirus în domeniul HCoV-229E NiRAN (8) a dus la o scădere a activității de NMPilare in vitro și o scădere semnificativă a replicării virusului în cultura celulară (Figura 3D, E și SI) anexa, Figura S3).Datele sunt în concordanță cu funcția de reglare importantă a acestui reziduu, cum ar fi restul Phe al motivului DFG omolog prezentat anterior.În protein kinazele clasice, face parte din bucla de legare a Mg2+ și ajută la asamblarea și reglarea coloanei vertebrale???Necesar pentru o activitate catalitică eficientă (32, 34).Înlocuirea Ala și Arg cu resturile K4116 (în motivul preAN), respectiv, a eliminat replicarea virală și, așa cum era de așteptat, a avut efecte diferite asupra activității transferazei NMP in vitro, în funcție de lanțul lateral de aminoacizi introdus (Figura 3D și apendicele E și SI , Figura S3).Datele funcționale sunt în concordanță cu informațiile structurale, indicând faptul că acest reziduu a stabilit o interacțiune cu ATP fosfat (17).În domeniul NiRAN al altor familii de virusuri imbricate, poziția HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 este ocupată de Lys, Arg sau His (8), ceea ce indică faptul că restricția funcțională a acestui reziduu specific a fost relaxată.Înlocuirea lui D4188A și D4283A elimină sau reduce puternic activitatea enzimatică și elimină replicarea virusului (Figura 3).Aceste două reziduuri sunt conservate în majoritatea (dar nu în toți) virusurile imbricate (8), indicând o funcție importantă specifică familiei, dar posibil non-catalitică.Substituțiile Ala ale altor câteva resturi Lys și Asp (K4113A, D4180A, D4197A și D4273A) care nu sunt conservate în Coronaviridae sau în alte familii Nestioviridae (8) au fost utilizate ca martori.După cum era de așteptat, aceste substituții sunt în mare măsură tolerabile, cu o scădere ușoară a activității enzimatice și a replicării virale în unele cazuri (Figura 3 și apendicele SI, Figura S3).În general, datele privind mutageneza coronavirusului sunt foarte în concordanță cu datele de auto-GMP și genetică inversă ale EAV NiRAN-RdRp (16), în care EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) reziduul K94 (corespunzător HCoV-229E K4135) funcții importante), R124 (corespunzător cu R4178), D132 (corespunzător cu D4188), D165 (corespunzător cu D4280), F166 (corespunzător cu F4281).În plus, datele de mutageneză HCoV-229E sunt în concordanță și extinse de la datele de genetică inversă SARS-CoV raportate anterior (16), la fel de similare cu cele observate pentru motivul CN corespunzător, mutantul Phe-to-Ala SARS-CoV_nsp12. fenotipul descris -F219A și HCoV-229E_F4281A (Figura 3 D și E și apendicele SI, Figura S3 și Tabelul S1-S4).
În comparație cu ortologii EAV (16), care au o preferință clară pentru UTP și GTP (în reacția de auto-NMPylation), studiul nostru arată că domeniul coronavirusului NiRAN (reprezentat de HCoV-229E și SARS-CoV-2) poate fi eficient transferate Toate cele patru NMP, deși există o ușoară preferință pentru UMP (Figurile 1 și 3).Specificitatea relativ scăzută a cosubstratului NTP specific este în concordanță cu structura supercompozită SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 raportată recent, în care ADP-Mg2+ se leagă de situsul activ al NiRAN, dar nu și cu partea de adenină. a formării interacţiunilor specifice (17).În studiul nostru, tipul de nucleotidă utilizat în reacția de NMPylation nu are niciun efect diferențial asupra activității proteinei mutante (Anexa SI, Figura S3), indicând faptul că niciunul dintre aceste reziduuri nu este strâns legat de legarea unei anumite nucleobaze.Baza structurală și potențiala semnificație biologică a diferitelor preferințe de co-substrat NTP observate în domeniile NiRAN ale coronavirusurilor și virusurilor arteriale rămân de studiat;ele pot fi adevărate sau se pot datora limitărilor studiilor lor respective.În prezent, nu poate fi exclus ca activitatea potențială NMPylator a domeniului NiRAN al virusului arterial (comparativ cu activitatea de auto-NMPylation caracterizată anterior) să aibă o preferință diferită de co-substrat, ținând cont de faptul că similitudinea dintre arterial și coronavirus. Domeniul NiRAN este la limita sa.Comparare bazată pe secvență (16).În comparație cu pseudokinaza SelO, care utilizează Mg2+ ca cofactor, activitatea coronavirusului și a virusului arterial NiRAN este dependentă de Mn2+ (16) (Figura 3C și apendicele SI, Figura S1).Dependența de Mn2+ și preferința evidentă pentru UTP este o caracteristică neobișnuită a proteinelor NMPylators și a fost confirmată doar recent în proteina YdiU a Salmonella typhimurium, care catalizează UMPylarea strictă a proteinei dependente de Mn2+ pentru a proteja celulele de inducerea stresului. 33).
Asemănarea structurală descrisă recent între domeniul coronavirusului NiRAN și protein kinazele celulare (17, 19) oferă un sprijin suplimentar pentru capacitatea NiRAN de a lega covalent NMP de alte proteine pe care le-am raportat în acest studiu.Ne-am concentrat căutarea posibilelor ținte NiRAN pe proteinele codificate de HCoV-229E ORF1a, despre care se știe că ajută direct sau indirect replicaza codificată cu ORF1b a RTC (12, 35).Experimentele noastre oferă dovezi concludente pentru NMPilarea eficientă și specifică a nsp9 (Figura 2).Dacă proteina țintă este utilizată într-un exces molar care este de 8 până la 10 ori mai mare decât cel al enzimei (nsp12), se confirmă că nsp9 este complet (mono)NMPizat (Figura 4).Am ajuns la concluzia că interacțiunea dintre nsp12 și nsp9 este de scurtă durată și nu va forma un complex stabil cu nsp9 (în absența altor subunități RTC).Această concluzie este susținută de studiile de interacțiune a proteinelor pe proteomul SARS-CoV (35).Analiza MS a identificat amina primară a reziduului N-terminal al nsp9 ca situl de NMPilare (apendicele SI, Figura S5).Formarea legăturii fosforamidat și a grupării amino N-terminale distinge activitatea de NMPilare mediată de NiRAN de reacția de AMPilare mediată de Pseudomonas syringae SelO, care catalizează formarea de AMP legat de O la aductul peptidic al reziduurilor Ser, Thr sau Tyr ( 22), iar S. typhimurium YdiU formează aducti peptidă-UMP legați O (cu Tyr) și N-legați (cu His).Informațiile limitate disponibile despre familia de proteine SelO indică faptul că membrii acestei familii mari de proteine diferă foarte mult în formarea de aducti peptidă-NMP.Aceasta este o observație interesantă care merită un studiu suplimentar.
Datele obținute în acest studiu ne-au determinat să facem ipoteza că NMPilarea nsp9 necesită un N-terminal liber.În contextul replicării virale, aceasta va fi asigurată de clivajul proteolitic al situsului de procesare nsp8|nsp9 din poliproteina replicază pp1a mediată de Mpro și pp1ab.În majoritatea coronavirusurilor, diferența dintre acest site specific (VKLQ|NNEI în HCoV-229E) și toate celelalte site-uri de clivaj Mpro coronavirus este Asn (mai degrabă decât un alt reziduu mic, cum ar fi Ala, Ser sau Gly) ocupă P1â???Locație (36).Datele de clivaj peptidice obținute în primele studii au arătat că eficiența de clivaj a site-ului nsp8|nsp9 a fost mai mică decât cea a altor situsuri, indicând că 1) acest site specific poate avea un rol de reglementare în procesarea coordonată în timp util a C-terminalului. regiunea pp1a sau 2) a Rolul N-terminalului special conservat nsp9 în replicarea virusului (37).Datele noastre (Figura 5A) au arătat că forma recombinantă a nsp9 care poartă secvența N-terminală reală a fost NMPizată eficient de nsp12.Secvența de flancare N-terminală a fost îndepărtată de factorul Xa (nsp9-His6; apendicele SI, Tabelul S1) sau clivaj mediat de Mpro (nsp7-11-His6; Figura 5A și apendicele SI, Tabelul S1).Important, precursorul netăiat care conține nsp9 nsp7-11-His6 a arătat rezistență la NMPilarea nsp12, ceea ce este în concordanță cu datele noastre, indicând faptul că aductul nsp9-NMP este format prin amina primară N-terminală (apendicele SI, Figura S5) .Pentru a obține o înțelegere mai profundă a specificității substratului NiRAN, ne-am concentrat apoi pe reziduurile N-terminale adiacente ale nsp9.În absența altor proteine, ele sunt flexibile structural, împiedicându-le să fie detectate în forma nemarcată a nsp9 (26 28, 38), indicând variația lor naturală limitată. Acest lucru se datorează secvenței importante specifice (nu legate de structura secundară) funcția fragmentului N-terminal nsp9.Substituțiile Ala ale reziduurilor conservate în această regiune (Figurile 5C și D și apendicele SI, Figura S8) arată că N3826 este esențial pentru NMPilarea nsp9 in vitro, în timp ce substituțiile N3825A și E3827A duc la o scădere a NMPilării, în timp ce substituțiile M3829A și P3830A nu o fac. .Evident, afectează nsp9 NMPylation.Deși înlocuirea Asn N-terminal (N3825A, N3825S) are doar un efect moderat asupra NMPilării nsp9 și replicării virusului în cultura celulară (Figura 5C și D), ștergerea unei secvențe de reziduuri Asn din dipeptida N-terminală 3825-NN s-a dovedit a fi Este letal pentru viruși, indicând faptul că un reziduu Asn este necesar înaintea altui reziduu la capătul N-terminal, de preferință Asn, deși se pare că înlocuirea unor resturi similare poate fi parțial tolerată (Figura 5B, C și D).Concluzionăm că dipeptida 3825-NN, în special reziduul N3826 conservat și esențial din domeniul coronavirusului (apendicele SI, Figura S6), asigură legarea și orientarea corectă a N-terminalului nsp9 în situsul activ al NiRAN.
Înlocuirea Ala (E3827A) cu Glu conservat al tuturor subfamiliilor păstrează NMPilarea nsp9 in vitro, dar este letală pentru virușii din cultura celulară (Figura 5C și D), indicând funcția suplimentară a acestui reziduu, de exemplu, în interacțiunile cheie (NMPilat sau nemodificat). ) nsp9 N-terminal și alți factori implicați în replicarea virusului.Mutațiile Nsp9 nu au afectat procesul proteolitic al nsp9 sau al oricărui nsps adiacent (39) (Anexa SI, Figura S9), indicând faptul că fenotipurile letale ale mai multor mutații nsp9 observate nu au fost cauzate de dereglarea procesului proteolitic C-zona pp1a terminală. .
Datele de mai sus furnizează dovezi că, după tratamentul mediat de Mpro al situsului de clivaj nsp8|9 în pp1a/pp1ab, capătul N-terminal al nsp9 poate fi UMPilat (sau modificat parțial cu un alt NMP).În plus, conservarea excelentă a capătului N-terminal al nsp9 (inclusiv reziduurile Asn singulare și invariante din familia coronavirusului) și datele de genetică inversă obținute în acest studiu (Figurile 3E și 5D) ne-au determinat să concluzionam că NMPylation nsp9 descrisă. este înrudit biologic și esențial pentru replicarea coronavirusului.Consecințele funcționale ale acestei modificări rămân de studiat, de exemplu, în ceea ce privește activitatea de legare a ARN nsp9 (nespecifică) descrisă anterior (2628).NMPilarea N-terminală poate afecta, de asemenea, interacțiunea nsp9 cu substraturi de proteine sau ARN sau formarea diferitelor ansambluri cu patru niveluri.Acestea au fost observate în studiile structurale și s-au confirmat că sunt legate funcțional de replicarea coronavirusului, deși mai ales în absența în cazul acestei modificări (26-ââ29, 40).
Deși specificitatea țintă a domeniului coronavirusului NiRAN trebuie încă caracterizată mai detaliat, datele noastre arată că specificitatea țintă proteică a domeniului coronavirusului NiRAN este foarte îngustă.Deși conservarea reziduurilor cheie ale situsului activ (8, 16) în domeniul NiRAN al tuturor familiilor de nidovirus susține puternic activitatea NMPylator conservat acestor proteine, identitatea reziduurilor de buzunar de legare la substrat ale acestui domeniu Conservarea și conservarea rămân de caracterizat. , și poate diferi între diferite familii de scopuri Nidovirales.În mod similar, țintele relevante ale altor viruși imbricați încă nu au fost determinate.Ele pot fi ortologi la distanță ai nsp9 sau a altor proteine, deoarece secvențele din afara celor cinci domenii de replicază care sunt în general conservate în virușii imbricați sunt mai puțin conservate (8), inclusiv matricea genomului dintre Mpro și NiRAN, printre ele, nsp9 este situat în coronavirus.
În plus, nu putem exclude în prezent posibilitatea ca domeniul NiRAN să aibă ținte suplimentare (inclusiv celulare).În acest caz, merită menționat că omologii bacterieni din această proteină emergentă NMPylators (NMPylators) (30, 31) par să aibă „regulatori maeștri”?NMP modulează o varietate de proteine celulare pentru a regla sau elimina activitățile lor din aval, jucând astfel un rol într-o varietate de procese biologice, cum ar fi răspunsul la stres celular și homeostazia redox (22, 33).
În acest studiu (Figurile 2 și 4 și apendicele SI, figurile S3 și S5), am putut demonstra că nsp12 a transferat partea UMP (NMP) într-o singură poziție (conservată) în nsp9, în timp ce alte proteine nu au fost modificate în utilizat În condițiile, este acceptată specificitatea substratului bine definită (mai degrabă decât liberă).În concordanță cu aceasta, în comparație cu NMPylation nsp9 N-terminal, activitatea de NMPylation proprie a nsp12 este foarte scăzută, detectarea acesteia necesită un timp mai lung de expunere la autoradiografie și se utilizează o creștere de 10 ori a concentrației nsp12.În plus, analiza noastră MS nu a reușit să furnizeze dovezi pentru NMPilarea nsp12, ceea ce sugerează că auto-NMPilarea domeniului NiRAN este (în cel mai bun caz) o activitate secundară.Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că alte studii au furnizat dovezi preliminare că starea de auto-AMPilare a NMPylator bacterian poate controla activitatea lor de NMPilare pe alte substraturi proteice (22, 33).Prin urmare, este nevoie de mai multe cercetări pentru a investiga posibilele efecte funcționale ale activităților de auto-NMPylation raportate pentru EAV nsp9 (16) și coronavirus nsp12 (acest studiu), inclusiv efectul de însoțire propus asupra plierii domeniului C-terminal RdRp ( 16) ).
Anterior, au fost luate în considerare mai multe ipoteze privind posibilele funcții în aval ale domeniului NiRAN nidoviral, inclusiv ARN ligaza, guanilat transferaza ARN-capped și activitatea de amorsare a proteinei (16), dar niciuna dintre ele nu este compatibilă cu funcțiile disponibile în aval.Informațiile obținute în următoarele poziții sunt exact în același timp fără a face ipoteze suplimentare.Datele obținute în acest studiu sunt cel mai în concordanță cu (dar nu pot dovedi) că domeniul NiRAN este implicat în inițierea sintezei ARN-ului indus de proteine.Se credea anterior că funcția domeniului NiRAN în 5??Reacțiile de plafonare ²-ARN sau de ligatură a ARN nu sunt afectate de acestea și de Suportul altor date.Prin urmare, de exemplu, se consideră că locul activ al NiRAN implică Asp conservat ca bază generală (D252 în Pseudomonas syringae SelO; D4271 în HCoV-229E pp1ab; D208 în SARS-CoV-2 nsp12) (Anexa SI, figura 2). ).S2) (17, 22, 33), în timp ce cataliza în ARN ligaza dependentă de ATP și enzima de acoperire a ARN este efectuată de intermediarul enzimei covalente-(lisil-N)-NMP, care implică un rest Lys nemodificat ( 41).În plus, specificitatea remarcabilă bazată pe secvență a coronavirusului NiRAN pentru țintele proteice conservate și specificitatea relaxată pentru co-substratele NTP (preferă UTP) se opune enzimei de limitare mediate de NiRAN sau funcțiilor asemănătoare ARN ligazei.
Evident, este nevoie de multă muncă suplimentară pentru a verifica și, dacă s-a dovedit, a elabora posibilul rol al nsp9-UMP (nsp9-NMP) în sinteza ARN indusă de proteine, care va conecta mai multe rapoarte interesante, dar (până în prezent) raportate anterior. .Observații izolate.De exemplu, s-a determinat că capătul ARN-ului negativ al coronavirusului începe cu o catenă oligo(U) (42, 43).Această observație este în concordanță cu ideea că sinteza ARN-ului negativ este inițiată prin legarea formei UMPilate a nsp9 la coada poli(A) (declanșatoare), care poate fi promovată prin legarea sa de ARN. Activitatea și/sau interacțiunea cu altă proteină RTC.Porțiunea UMP furnizată de nsp9 poate fi apoi utilizată ca „amors” pentru oligouridilarea mediată de nsp7/8/nsp12, folosind coada 3??²-poli(A) din ARN-ul genomic sau o altă secvență care conține oligo (A) servește ca șablon, similar mecanismului stabilit pentru proteina picornavirus VPg (44).Ce se întâmplă dacă propunerea este „nenormativă”????Inițierea sintezei ARN-ului cu catenă negativă (indusă de proteine) oferă o legătură cu observațiile, indicând faptul că ARN-ul catenului negativ al coronavirusului are UMP (în loc de UTP) la capătul său (42), ceea ce se consideră că indică faptul că acidul nucleic Dicer scindează capătul fosforilat de o endonuclează specifică uridinei necunoscută.Dacă este confirmată, această activitate hidrolitică a acidului nucleic poate ajuta la eliberarea formei oligomerică UMPilată a nsp9 de la capătul 5 ² al catenei negative în curs de dezvoltare.Posibilul rol al nsp9 în amorsarea proteinei este, de asemenea, în concordanță cu studiile anterioare de genetică inversă, care au arătat că nsp9 (și nsp8) interacționează în mod critic și specific cu elementul ARN conservat cu acțiune cis, în apropiere de capătul 3 al genomului coronavirusului.45).Potrivit acestui raport, aceste observații anterioare pot fi acum reexaminate și extinse prin cercetări ulterioare.
În rezumat, datele noastre au determinat activitatea specifică a unei etichete de enzimă virale imbricate de proprietate, legate de RdRp la capătul N-terminal.În coronavirus, această activitate UMPylator/NMPylator mediată de NiRAN recent descoperită este utilizată pentru a se baza pe Mn2+ și pe reziduurile Asn adiacente și pentru a provoca formarea de legături fosforamidate (de energie scăzută) cu amina primară N-terminală.Prin clivajul mediat de Mpro la site-ul de clivaj nsp8|9, ținta nsp9 poate fi utilizată pentru NMPilare, indicând cuplarea funcțională dintre protează și domeniul NiRAN, care se extinde la RdRp.Conservarea reziduurilor cheie în situl activ nsp12 NiRAN și ținta nsp9, combinată cu datele obținute de la două coronavirusuri, inclusiv SARS-CoV-2, oferă dovezi puternice că nsp9 NMPylation este un coronavirus Caracteristicile conservatoare sunt, de asemenea, un pas cheie în replicarea virusului.Datele disponibile ne conduc la concluzia că rolul specific al formei NMPilate a nsp9 în sinteza ARN indusă de proteine este un scenariu rezonabil pentru coronavirus și alte viruși imbricați, iar NiRAN poate viza și alte proteine neidentificate.Reglați virusul.Interacțiunea gazdei.Dacă este confirmată, implicarea primerilor proteici în sinteza ARN viral va crește afinitatea secvenței domeniilor Mpro/3CLpro și RdRp între coronavirusul detectat anterior și supergrupul asemănător picornavirusului (9), care au fost acum unificați în Pisonivirites recent stabilite ( 46) în categoria.
Datele noastre arată, de asemenea, că activitățile enzimatice de bază, selective și conservatoare identificate în acest studiu pot fi utilizate ca ținte pentru medicamentele antivirale.Compușii care interferează cu legarea (și modificarea ulterioară) a capătului N-terminal nsp9 conservat în situsul activ al NiRAN pot fi transformați în medicamente antivirale eficiente și versatile, potrivite pentru tratamentul coronavirusurilor animale și umane din diferite infecții (sub)genuri. , inclusiv SARS-CoV-2 și coronavirusul sindromului respirator din Orientul Mijlociu.
Secvența de codificare a proteinei coronavirus produsă în acest studiu a fost amplificată prin RT-PCR folosind ARN izolat din Huh-7 infectat cu HCoV-229E sau Vero E6 infectat cu SARS-CoV-2 și inserat folosind proceduri standard de clonare.Vector de expresie pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) sau pASK3-Ub-CHis6 (47) (Anexa SI, Tabelele S1 și S2).Substituțiile de un singur codon au fost introduse prin mutageneză direcționată pe situs bazată pe PCR (48).Pentru a produce proteina de fuziune MBP, celulele E. coli TB1 au fost transformate cu constructul plasmid adecvat pMAL-c2 (apendicele SI, Tabelul S1).Proteina de fuziune a fost purificată prin cromatografie de afinitate cu amiloză şi scindată cu factor Xa.Ulterior, proteina marcată cu His6 C-terminal a fost purificată prin cromatografie de afinitate cu metal imobilizat cu Ni (Ni-IMAC) așa cum s-a descris anterior (49).Pentru a produce proteina de fuziune a ubiquitinei, celulele E. coli TB1 au folosit construcția plasmidică adecvată pASK3-Ub-CHis6 (Anexa SI, Tabelele S1 și S2) și ADN plasmidic pCGI care codifică hidrolaza 1 C-terminală specifică ubiquitinei (Ubp1).Transformare (47).Proteina coronavirus marcată cu His6 C-terminal a fost purificată așa cum s-a descris anterior (50).
Testul de auto-NMPilare a HCoV-229E nsp12-His6 a fost efectuat așa cum este descris în EAV nsp9 (16).Pe scurt, nsp12-His6 (0,5 µM) conține 50 mM acid 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetansulfonic (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM tampon incubat NTP-ul specificat și 0,17 uM s-au potrivit [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) la 30 °C timp de 30 de minute.În toate celelalte teste de NMPilare (standard) ale NMPilării nsp9 mediate de nsp12, condițiile de reacție sunt ajustate după cum urmează: nsp12-His6 (0,05 µM) și nsp9-His6 (4 µM) în prezența a 50 mM HEPES-KOH (pH 80. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCI2, 25 uM indicat NTP și 0,17 uM potrivit [a32-P]NTP.După incubare timp de 10 minute la 30°C, proba de reacție a fost amestecată cu tampon de probă SDS-PAGE: 62,5 mM tris(hidroximetil)aminometan HCI (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glicerol și 0,005% bromofenol albastru.Proteina a fost denaturată prin încălzire la 90 °C timp de 5 minute și separată cu 12% SDS-PAGE.Gelul este fixat și colorat cu soluție Coomassie Brilliant Blue (40% metanol, 10% acid acetic, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), decolorat și expus la un ecran de imagistică fosforescent timp de 20 de ore (pentru a detecta nsp12 din NMPylation) sau (maximum) 2 ore (pentru a evalua nsp9 NMPylation).A fost folosit un aparat de imagine Typhoon 9200 (GE Healthcare) pentru a scana ecranul, iar ImageJ a fost folosit pentru a analiza intensitatea semnalului.
Pentru analiza MS, 1 uM nsp12-His6 și 10 uM nsp9 (fără etichetă de hexahistidină) au fost utilizate în analiza NMPilării (anexa SI, Tabelul S1) și au fost utilizate concentrația crescută de 500 uM UTP și GTP.În funcție de concentrația lor și de calitatea așteptată a proteinei, un sistem HPLC Waters ACQUITY H-Class echipat cu o coloană MassPrep (Waters) a fost utilizat pentru a desalare 1 până la 10 µL de soluții de proteine tamponate online.Proteina desarate este eluată în sursa de ioni de electrospray a spectrometrului de masă Synapt G2Si (Waters) prin următorul gradient de tampon A (apă/0,05% acid formic) și tampon B (acetonitril/0,045% acid formic), iar temperatura coloanei este 60 ° C și un debit de 0,1 ml/min: se eluează izocratic cu 5% A timp de 2 minute, apoi un gradient liniar la 95% B în 8 minute și se menține 95% B timp de încă 4 minute.
Sunt detectați ionii pozitivi cu un interval de masă de la 500 la 5000 m/z.Glu-fibrinopeptida B este măsurată la fiecare 45 de secunde pentru corectarea automată a deplasării masei.Utilizați software-ul pentru instrumente MassLynx cu extensia MaxEnt1 pentru a deconvolve spectrul mediu după deducerea liniei de bază și netezirea.
HCoV-229E nsp9 UMPilat a fost digerat prin adăugarea de tripsină modificată de gradul de secvențiere (Serva) și incubat peste noapte la 37 °C.O coloană de rotație Chromabond C18WP (număr de piesă 730522; Macherey-Nagel) a fost utilizată pentru a desara și a concentra peptidele.În cele din urmă, peptida a fost dizolvată în 25 uL de apă, care conținea 5% acetonitril și 0,1% acid formic.
Probele au fost analizate prin MS utilizând un spectrometru de masă Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Cel mai bun sistem nanoâ HPLC (Dionex), echipat cu un dispozitiv personalizat de 50 cm?Coloana C18 RP de 75 μm ambalată cu bile magnetice de 2,4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Conectați-vă la spectrometrul de masă online prin sursa de nanospray Proxeon;injectați 6 µL de soluție de digestie cu tripsină într-un diametru interior de 300 µm ×??Coloană de pre-concentrare C18 PepMap de 1 cm (Thermo Scientific).Folosind apă/acid formic 0,05% ca solvent, proba a fost prinsă automat și desalinizată la un debit de 6 uL/min.
Următorii gradienți apă/0,05% acid formic (solvent A) și 80% acetonitril/0,045% acid formic (solvent B) au fost utilizați pentru a realiza separarea peptidelor triptice la un debit de 300 nL/min: 4% B pentru 5 minute, apoi 30 A gradient liniar la 45% B în câteva minute și o creștere liniară la 95% solvent B în 5 minute.Conectați coloana cromatografică la un nano-emițător din oțel inoxidabil (Proxeon) și pulverizați eluentul direct pe capilarul încălzit al spectrometrului de masă folosind un potențial de 2.300 V. Scanarea sondajului cu o rezoluție de 60.000 în analizorul de masă Orbitrap este asociată cu cel puțin trei scanări MS/MS de date, excluse dinamic timp de 30 de secunde, utilizând disocierea indusă de coliziunea cu capcană de ioni liniară sau disocierea coliziunii cu energie mai mare combinată cu detectarea orbitrapului, Rezoluția este de 7.500.
Ora postării: Aug-03-2021